Цистрон Бензера

Когда Бензер уяснил для себя, сколько места занимает на хромосоме одна точечная мутация и сколько нуклеотидов может разъединяться при кроссинговере, неотвратимо встал вопрос: а какова длина одного гена?

В то время наука уже знала, что один ген участвует в построении одного фермента, иными словами, информация, заложенная в одном гене, обеспечивает создание одной молекулы белка. Но сколько места занимает на хромосоме один ген? Пять-шесть нуклеотидов? Несколько сотен или тысяч?

Секрет размеров гена помогли разгадать все те же знаменитые rII-мутанты. Помните, поначалу область rII называли геном rII. Считалось, что он занят в таинственном процессе созидания молекул белка, которые необходимы фагу для размножения и формирования его крупных "быстрых" бляшек на кишечной палочке К. Какой это белок, никто не знал. Но в том, что ген rII занят выработкой белка, сомнений не было. А почему белка? Может быть, белков? Кто поручится за то, что в области rII на хромосоме фага расположился только один ген, а не два, не три и не четыре? Раз родившись, этот вопрос уже не давал Бензеру покоя. И ученого можно понять: здесь заключался секрет длины гена. Игра, как говорится, стоила свеч.

В этих опытах исследователь приспособил для фагов цис-транс-тест. Что это такое? В клетках, имеющих две хромосомы-близнеца (это клетки высших организмов с двойным набором хромосом или бактерии, зараженные смесью двух фагов), две разные мутации могут "искалечить" только одну хромосому из двух. В этом случае говорят, что мутации находятся в цис-положении (от латинского цис - по эту сторону). Оно проходит безболезненно для клетки высших организмов потому, что нормальные, немутировавшие гены второй хромосомы компенсируют деятельность генов, затронутых мутацией. Именно в присутствии второй хромосомы в каждой клетке высших животных и растений - секрет устойчивости жизненных форм. Вторая хромосома способна скомпенсировать даже несколько повреждений другой хромосомы.

Хуже обстоит дело, если две мутации попадут на разные хромосомы, то есть создастся транс-положение (от латинск. транс - по ту сторону). Собственно говоря, если они повредят разные участки гена, то никаких изменений в функции клетки также не будет. Комплементарный участок хромосомы-близнеца своей работой скомпенсирует повреждение другой хромосомы. Но беда, если мутации "ударят" по одному и тому же месту на обеих хромосомах (их называют некомплементарными). Тогда у клетки повредится функция (она прекратит выработку фермента).

Комплементарные и некомплементарные мутации для построения хромосомных карт впервые применил для дрозофил Льюис. Он и назвал этот метод цистранс-тестом, или тестом на комплементарность.

Ну, а Бензер? Он приспособил этот метод для исследования мутаций у фагов. Но о какой комплементарности мутаций может идти речь, если у фага Т4, с которым занимался Бензер (как, впрочем, и у других фагов), всего одна-единственная хромосома? Это действительно так, пока... в тело бактерии не попали, скажем, два близкородственных фага. Тогда набор хромосом будет уже двойным, и к нему вполне применим новый метод.

Все эти рассуждения требовали подтверждения экспериментом. И в тело все той же кишечной палочки К ученый ввел два фага. Один из них - ничем не примечательный дикий тип, другой - мутант rII. Какие фаги-потомки выйдут из "стенок" бактерии - дикие или мутанты? Тут и двух мнений быть не могло: конечно, дикие, ведь мутант rII, как известно, не способен размножаться на этой среде. И в самом деле. На чашках, куда вчера засеяли фагов, рожденных в бактерии К, появились, как и следовало ожидать, колонии дикого типа. Но вот рядом одна бляшка, другая... Да ведь это rII-мутанты! Фаг дикого типа каким-то чудесным образом помог фагу, искалеченному мутацией, произвести на свет потомков. И Бензер справедливо решил, что это и есть действие полноценной хромосомы.

Генетик-классик сказал бы: ген r⁺ дикого типа доминирует над мутантным rII-геном и компенсирует его повреждение.

А если заразить бактерию К двумя фагами-мутантами, которые порознь не размножаются на ней? Эксперимент был поставлен незамедлительно, и на суд ученых представились удивительные результаты: потомков дали оба фага-мутанта! Это могло означать лишь одно: мутации ударили по разным местам области rII. Они комплементарны и находятся в двух разных функциональных единицах.

Повреждение функции одного мутанта, заключил Бензер, компенсировалось нормальным диким местом в хромосоме другого, который, в свою очередь, получил компенсацию для своей "раны" от первого мутанта. Ведь дикое-то место на хромосоме доминирует. Ну, а если пара мутантов все-таки не размножается?.. Впрочем, и это понятно. Значит, у них мутация ранила одну и ту же функцию.

Мутантов, которые размножались при сосуществовании, Бензер отнес к двум функциональным группам: А и В. Причем скрещивание внутри одного класса ни к чему не приводило: мутации были некомплементарными. Но стоило в тело бактерии пробраться двум мутантам из разных групп, как с четкой закономерностью "нарождались" потомки того и другого фага.

И когда Бензер вновь обратился к своей карте области rII хромосомы фага Т4, то испытал беспредельное удовлетворение. Еще бы! Все мутации класса А располагались "плечом к плечу", друг за другом, а мутации класса В составили другой участок хромосомы.

Тогда Бензер провел пограничную черту, разделившую ген rII на две большие функциональные области: А и В. Ген rII состоял из двух независимо работающих единиц. Физик Бензер остался верен себе и назвал эти единицы цистронами. Теперь-то можно было узнать истинный размер куска хромосомы, принимающего участие в синтезе одного белка. Бензер вычислил его, исходя из процента рекомбинаций между точечными rII-мутантами, у которых мутации затронули края цистрона. У цистрона А он оказался равен 6 единицам карты, у цистрона В-4. Ученый подсчитал, что если вся карта включает 700 единиц, то цистрон А - это 6/700 ее части. А поскольку вся хромосома фага включает 2•10⁵ пар нуклеотидов, то длина цистрона А равна 6/700•2•10⁵-1700 пар нуклеотидов. Соответствующий расчет дает для цистрона В 1100 пар нуклеотидов в двойной спирали фаговой ДНК. В настоящее время известно, что вся хромосома фага Т4 содержит более 50 цистронов.

Цистрон - это единица неделимой функции, иначе говоря, некоторый отрезок на хромосоме, в котором закодирована способность созидать, как правило, один фермент. По размерам он, понятно, гораздо больше рекона. Таким образом, элементарной единицей гена, выступающей в рекомбинации и мутации, является отдельный неуклеотид. Элементарной единицей функции, контролирующей синтез какого-либо фермента, является цистрон. В этом смысле он ближе всего подходит к прежнему определению гена.

Удачи Бензера принесли надежду, что все генетические процессы можно будет изучать на уровне молекул. Генетика стала говорить языком химических формул. И, пожалуй, самое яркое свидетельство этому - карта области rII Бензера, где рядом с близкими черточками - "квартирами" мутаций появились кружки с этикеткой - названиями нуклеотидов.

"Рассадить" эти кружки по "грядкам" Бензеру помогли тысячи точечных мутаций, которые он нанес на карту с кропотливостью муравья, проделав неисчислимое количество опытов скрещивания фагов-мутантов с фагами-анализаторами: на карте было выявлено свыше 300 независимых друг от друга мутаций.

И вот что любопытно: не все места хромосомы фага, оказывается, мутируют одинаково. Вот "горящая точка" в сегменте А6с цистрона А, а вот вторая - в сегменте В4 цистрона В. Здесь мутации случались чрезвычайно часто. В других местах они - редкость. Причина "горения" неизвестна. Возможно, что на него влияет природа пар нуклеотидов в месте мутации и рядом с ней, возможно, - изгибы цепи ДНК в этих точках.

Исследования Бензера - это наиболее тонкий анализ гена, выполненный до сих пор. Ведь ему удалось "разобрать" ген до самых "косточек", картировать на нем элементарные единицы, из которых построены нуклеиновые кислоты, - нуклеотиды. Система фага и методика Бензера были удобнейшей моделью для такого рода исследований и обладали множеством преимуществ, за исключением одного: природа белков, которые строили фаговые цистроны Бензера, оказалась за семью печатями. И до сего времени ученым не известно, какие именно белки контролируют гены А и В на хромосоме фага Т4. Надо же было такому случиться в системе фага, на которой впервые в истории биологии были точно картированы функциональные единицы - цистроны!

Может быть, именно потому столь результативным оказалось изучение бензеровских цистронов на хромосомах бактерий. В самом деле. На бактериях легко определить функцию, которую контролируют изучаемые гены. Очень многие продукты жизнедеятельности бактерий изучены биохимически, и нередко с большой степенью достоверности можно решить, какое именно химическое вещество контролирует тот или иной ген. Достаточно вспомнить первые карты хромосомы кишечной палочки К12, чтобы убедиться в истинности этих заключений. Потому-то на бактериальной хромосоме удалось картировать гены, ответственные за биосинтез большинства аминокислот, целого ряда ферментов и многие другие. Правда, пути хромосомных картографов тут были иные.

В системе конъюгации можно картировать большие участки хромосом или даже всю хромосому, можно измерить ее длину в абсолютных единицах, которые не зависят от рекомбинации. Вот почему некоторые ученые считают конъюгацию идеальным методом для анализа тонкой структуры гена.

Вспомните, как исследователи, пользуясь результатами опытов конъюгации, стали вычислять размер единицы рекомбинации. Впрочем, мы в самом начале "споткнулись" на неизвестных нам загадках строения нуклеиновых кислот. Теперь, когда слово "нуклеотид" уже хорошо знакомо, можно вернуться в страну конъюгаций и рассказать о реконах, мутонах и цистронах бактериальных клеток кишечной палочки К12.

При трансдукции фаг-"почтальон" переносит от одной бактерии к другой один или несколько генов. Именно в этом проявилось особое преимущество системы для картирования хромосом бактерии. С помощью такого метода удалось нанести на карту хромосомы бактерий гены, лежащие рядом друг с другом. И, что самое важное, функция этих генов не в пример фаговым цистронам Бензера оказалась известной. И вот какое было сделано открытие.

Генетическая карта кишечной палочки К12, градуированная в интервалах, равных 1 минуте

Цистроны, контролирующие постройку одного жизненно важного вещества клетки, располагались по соседству, образуя генные области. Скажем яснее. Помните, еще Бидл и Татум показали, что количество генов, контролирующих синтез жизненно важного вещества клетки, соответствует числу ферментов, участвующих в его синтезе. Они нашли, что биосинтез триптофана совершается по этапам: антраниловая кислота - индолглицерофосфат индол триптофан. В таком многоступенчатом синтезе, заключили ученые, должно принимать участие не менее 3 ферментов и, следовательно, 3 генов.

Находки Бидл а и Татума были полностью подтверждены Демерецом, Яновским и их коллегами в опытах на бактериях. Способность синтезировать триптофан действительно оказалась под контролем нескольких генов. Но это еще не все. Гены были сцеплены, то есть лежали рядом, друг за другом в одном участке и в том же порядке, в котором шел биосинтез триптофана. В этом исследователей убедили опыты по трансдукции: гены передавались фагами всегда совместно! Демерец узнал об этом, работая с салмонеллой, а Яновский и его коллеги - с кишечной палочкой.

Итак, цистроны, бьющие в одну цель, то есть цистроны, контролирующие последовательные реакии одного и того же биохимического процесса, склонны к объединению.

Казалось, что природа логична до конца. Она не выдумывала для каждого микроба своего закона жизни, а действовала так, как ей казалось наиболее экономично. Но... Это "но" не замедлило появиться, когда американские ученые Гартман, Эймз и их сотрудники в начале 60-х годов стали изучать у той же салмонеллы гены, контролирующие синтез аминокислоты гистидина. В нем участвовало... 10 ферментов! Но последовательность расположения их генов не соответствовала очередности этапов биосинтеза.

Более того. В других исследованиях нашли, что гены, контролирующие несколько этапов постройки одного и того же вещества, могут лежать на хромосоме бактерии на значительном расстоянии друг от друга.

В чем тут тайна? Этого еще никто не знает. Она пока во власти времени.

Расшифровка строения гена стала той основой, на которой биохимики выткали ткань теории информационного кода способа передачи наследственной информации от ДНК хромосом к белкам. И эту область биологии невидимки одарили с царской щедростью. Бактерии и их вирусы-фаги были, пожалуй, единственными участниками опытов по доказательству триплетности кодового числа, раскрытию секретов передачи информации с ДНК на РНК, распутыванию клубков загадок работы нуклеиновых кислот на "строительных площадках" клетки, где создавались белки. Вот почему настало время подробнее познакомиться с процессом биосинтеза белков - важнейших веществ живой материи, в которых проявляется своеобразие наследственности каждого из обитателей земли.