Методика

Создание пула мутантов- со вставками Tn10

1. Проведите транспозиционное скрещивание (как это описано в эксперименте 1). Используйте такие количества фага и клеток, чтобы получить примерно 500 колоний трансдуктантов на чашку. Сделайте десять таких чашек. Инкубируйте их двое суток при 40°С.

2. В каждую чашку налейте по несколько миллилитров бульона LB с ЭГТА (10 мМ). Пользуясь стеклянным шпателем, суспендируйте колонии в этой жидкости и все суспензии слейте в один сосуд. Хорошо перемешайте. Разведите суспензию до примерно 108 клетка/мл в среде LB + ЭГТА + тетрациклин (10 мкг/мл). Инкубируйте в течение ночи при 37°С со встряхиванием.

Выращивание трансдуцирующего фага на пуле инсерционных мутантов

3. Дважды промойте культуру собранных вместе инсерционных мутантов со вставками. Для этого два раза отцентрифугируйте клетки, ресуспендируя их в среде Е. Промытой суспензией засейте 1,0 мл бульона LB, чтобы получить препарат лизата трансдуцирующего фага Р22 (см. методику 3). Остаток промытого пула инсерционных мутантов сохраните.

4. Смешайте полученную свежую ночную культуру с 4,0 мл бульона с фагом Р22 (среда LB, содержащая 5·10⁶ БОЕ/мл фага Р22; см. методику 3). Инкубируйте, встряхивая при 37°С в течение 5-18 ч до тех пор, пока не наступит лизис. Если лизиса не произойдет даже и через 18 ч, переходите к следующим этапам. Такой способ выращивания фага описан в методике 3.

5. Проведите центрифугирование, чтобы осадить клетки и их обломки. Надосадочную жидкость слейте в пробирку с 0,25 мл хлороформа. Энергично перемешайте в смесителе Vortex, чтобы простерилизовать лизат. Полученный лизат должен содержать 10¹⁰-10¹¹ БОЕ/мл.

Выделение мутантов со вставками Tn10

6. Вырастите культуру TR5989 (purB12).

7. Проведите трансдукционное скрещивание на среде Е, высевая 0,1 мл свежей ночной культуры TR5989 (purB12) и ряд объемов (0,01-0,1 мл) фага Р22, выращенного на пуле мутантов со случайными вставками Tn10. Приготовьте около 10 таких чашек. Инкубируйте при 37°С до тех пор, пока колонии трансдуктантов не вырастут настолько, что их можно будет перепечатывать (36-48 ч).

8. Перепечатайте колонии с трансдукционных чашек на чашки E + ЭГТА и на чашки Е + ЭГТА + тетрациклин (10 мкг/мл). Инкубируйте при 37°С столько времени, чтобы можно было сравнить рост на этих чашках (24-48 ч).

9. Выявите тех трансдуктантов, которые выросли и на чашке Е, и на чашке Е + тетрациклин. Отберите уколом трансдуктантов с чашек, содержащих тетрациклин, и рассейте штрихом до отдельных колоний на индикаторные чашки Green + тетрациклин. Отберите и рассейте по возможности 10-20 таких трансдуктантов. Инкубируйте чашки со штрихами при 37°С до тех пор, пока колонии не вырастут настолько, что проявится их окраска (18-24 ч).

10. Из каждого штриха отберите уколом хорошо изолированную бледноокрашенную колонию и засейте ею небольшой объем среды LB (1,0 мл).

11. На чашку Green поперек штриха фага P22 (c2) нанесите штрихами каждую из полученных культур, чтобы проверить их чувствительность к фагу.

Проверка сцепления Tn10 с мутацией purB12

12. Вырастите культуру TR5989.

13. Используя фаги, выращенные на каждом из штаммов с предполагаемой вставкой Tn10 вблизи purB, проведите трансдукцию клеток TR5989 (purB12) к устойчивости к тетрациклину. Смешивайте по 0,01-0,1 мл фага и 0,1 мл свежей ночной культуры TR5989 на поверхности чашек LB + тетрациклин (20 мкг/мл). Инкубируйте 24 ч при 37°С.

14. Каждую трансдукционную чашку перепечатайте на среду Е + тетрациклин + ЭГТА и на среду Е + аденин + тетрациклин + ЭГТА. Инкубируйте чашки-реплики при 37°С/(24-36 ч).

15. Подсчитайте долю трансдуктантов Tet^R, являющихся одновременно Ade⁺. Заложите на хранение культуры тех штаммов, которые показали достаточно тесное сцепление (более чем 10% совместного наследования Ade⁺ и Tet^R). Для этого вернитесь к той чашке, на которой сохранились исходные чувствительные к фагу штаммы с Tn10. Отберите клетки тех штаммов, у которых вставки Tn10 оказались сцепленными с геном purB12, посейте их в столбики для хранения. Занесите эти штаммы в журнал с указанием процентов котрансдукции вставок Tn10 с мутацией purB.