Обсуждение

1. Это можно сделать одновременно с проведением транспозиции в эксперименте 1.
2. Важно, чтобы во все среды, используемые для суспендирования и выращивания этих пулов, был добавлен ЭГТА. В этих средах содержится некоторое количество фага, и если не окажется ЭГТА, то он сможет размножаться. Смысл этого в том, чтобы во время подращивания пула возникали и персистировали чувствительные к фагу клоны. Полученный таким способом пул из примерно 10000 клонов с транспозициями включен в набор штаммов. Его следует выращивать в присутствии ЭГТА и хранить при -70°С. При использовании его для размножения фага с ним следует обращаться так, как это описано ниже.
3. Проводят промывки, чтобы удалить ЭГТА из препарата, используемого для размножения трансдуцирующего фага Р22 на пуле клеток. Среду Е применяют потому, что она содержит кальций. Вероятно, можно применять и любой другой буфер с кальцием. Суспензию промытых клеток можно хранить при низкой температуре и позднее использовать ее как источник мутантов (методы хранения см. в приложении 3). Используемый в этом и в других экспериментах по общей трансдукции штамм фага P22 несет две мутации: мутацию int^- (предотвращает интеграцию и образование стабильных лизогенных бактерий) (Smith, Levine, 1967) и мутацию HT (обусловливает повышенную частоту упаковки в фаг хромосомы клетки-хозяина) (Schmieger, 1972). Эти мутации обеспечивают высокие частоты трансдукции и позволяют получать трансдуктантов, не являющихся лизогенными по фагу P22. На этой стадии пул мутантов, несущих вставки, можно заморозить, чтобы использовать его в будущем (см. приложение 3).
4. Фаг P22 в бульоне (см. методику 3) вполне стабилен даже при комнатной температуре, но обычно его хранят при 4°С. Лизис при размножении фага можно обнаружить по просветлению культуры или по появлению нитей обломков клеток. Даже если и не заметно видимых признаков лизиса, все равно таким способом получаются препараты фага, пригодные для использования.
5. После перемешивания с хлороформом в смесителе Vortex суспензию лучше оставить при комнатной температуре на несколько часов или на ночь, чтобы повысить гибель клеток от хлороформа. После этого суспензию (с хлороформом) следует хранить при 4°С.
6. (Этап 7); используют несколько концентраций фага, чтобы компенсировать непостоянство титра фага в донорном лизате и вариации в эффективности трансдукции штамма-реципиента.
7. (Этап 8); важно, чтобы на этих чашках-репликах сохранились селективные условия (среда Е), так как в противном случае сможет расти исходный реципиентный штамм TR5989 (purB12).
8. (Этап 9); чтобы снизить вероятность получения нелизогенных чувствительных к фагу трансдуктантов, очистку трансдуктантов следует проводить по возможности сразу после того, как они четко выявятся. Необходимо проводить очистку нескольких колоний Tet^R, так как некоторые из них могут оказаться двойными трансдуктантами, у которых вставка Tn10 не сцеплена с геном purB. Другие могут проявить лишь слабое сцепление с геном purB.
9. (Этап 10); колонии, в которых активно размножается фаг P22, должны быть темно-зелеными, нелизогенные штаммы - светлыми (бледно-зелеными). Стабильные лизогенные штаммы должны быть слегка темнее нелизогенных, но достоверно разглядеть это различие трудно.
10. (Этап 15); на этой стадии полезно сохранить два трансдуктанта: одного, несущего purB + и Tn10, и другого - мутацию purB12 и Tn10. Оба могут пригодиться при конструировании штаммов. Можно выделить лизогенную пару штаммов (purB12 и purB⁺), сохранив при последнем тесте на сцепленность по одному трансдуктанту каждого типа; оба штамма будут содержать Tn10 вблизи гена purB.

Литература

Schmieger H., 1972. Prage P22 mutants with increased or decreased transduction abilities, Mol. Gen. Genet., 119, 75.

Smith H. O., Levine H., 1967. A phage P22 gene controlling integration of prophage, Virology, 31, 207.