Обоснование и план эксперимента

При многих перестройках, индуцированных Tn10, происходит утрата детерминант устойчивости к лекарственным препаратам. Поэтому если взять штамм, содержащий вставку Tn10 в интересующей нас области, и проводить отбор клеток, утративших лекарственную устойчивость, то можно получить популяцию, сильно обогащенную делениями (или инверсиями) вблизи исходного сайта локализации Tn10.

Такой эксперимент проще провести, если использовать метод отбора, разработанный недавно Бохнером и др. (Bochner et al., 1980). Метод этот позволяет проводить прямой отбор клеток, чувствительных к тетрациклину. С помощью этого метода легко можно получить популяцию спонтанных мутантов, а уже затем проверять их на наличие делеций желаемого типа. В основе этого метода отбора лежит предположение (не доказанное), что тетрациклин проникает в клетки с помощью механизма, предназначенного для транспорта железа; эта система транспорта может блокироваться индуцибельным детерминантом устойчивости Tn10. Когда система поглощения железа блокирована, клетки оказываются неспособными расти на среде с низкими концентрациями железа. Добавляя в среду соединения, захватывающие железо, можно сделать рост полностью индуцированных клеток Tet^R зависимым от железа, добавляемого извне.

Описанный ниже эксперимент включает поиск делеций, вызываемых Tn10, встроенным вблизи his-оперона. Кроме делеций могут встречаться и инверсии, которые препятствуют экспрессии гена hisD, либо нарушая целостность кодирующей последовательности этого гена, либо отделяя ген hisD от его промотора.

Трансдукционные скрещивания с донорным фагом, выращенным на ряде точковых мутантов, позволяют выявить, действительно ли произошла делеция, и определить размер удаленного при этом участка гена hisD.