Методика

Отбор мутантов, чувствительных к тетрациклину (Tet^S)

1. Вырастите культуры:

TT1151 (hisC8691 :: Tn10, ориентация А), 
TT1127 (hisC8667 :: Tn10 ориентация В) или 
TT513 {zee=2 :: Tn10, ориентация А). 

2. Разведите культуру 1:100 примерно до 2·10⁷ клетка/мл. Высейте около 1·10⁶ клеток (0,05 мл) на чашку со средой Бохнера. Для каждого штамма приготовьте около пяти таких чашек, варьируя количество высеянных на чашку клеток от 5·10⁵ до 5·10⁶. Инкубируйте в течение 24-36 ч при 37°С.

3. Отберите уколом колонии с этих селективных чашек и рассейте штрихом до отдельных колоний на чашках со средой Бохнера.

Выявление мутантов hisD

4. Отдельные колонии перепечатайте по шаблону на чашки (около 200 колоний). Инкубируйте засеянные по шаблону чашки в течение ночи при 37°С.

5. Перепечатайте чашки, засеянные по шаблону, на пять сред: Е; Е + гистидин; Е + гистидин +тетрациклин; Е + гистидинол и LB. Инкубируйте в течение ночи при 37°С.

6. Выявите мутантов, чувствительных к тетрациклину и неспособных расти на среде с гистидинолом (hisD^-). Отберите уколом таких hiD-мутантов Tet^S и рассейте их для получения отдельных колоний на чашках с питательной средой (без тетрациклина). В случае штамма TT513 сохраните также такие колонии, которые растут на среде Е + гистидинол, но не растут на минимальной среде.

Характеристика новых мутантов hisD

7. Посейте жидкие культуры из отдельных колоний новых мутантов his.

8. Разотрите по 0,1 мл культур мутантов на чашках Е +низкая концентрация гистидина. После того как жидкость впитается, нанесите капли лизатов картирующих фагов, выращенных на серии точковых his-мутантов (см. эксперимент 7). Чашки не переворачивайте. Инкубируйте при 37°С.

9. Просмотрите результаты картирующих скрещиваний.

10. Сохраните все охарактеризованные делеционные или инверсионные мутанты, заложив их в столбики. Занесите их в журнал.