Обсуждение

1. В штамме TT513 вставка Tn10 находится вне оперона со стороны его промотора. Штаммы TT1151 и TT1127 содержат вставки Tn10 внутри гена hisC, который находится непосредственно рядом с геном hisD ближе к промотору.
2. Отбор будет происходить лишь в том случае, если на чашку высевать небольшое количество клеток (10⁶ или менее). Отбор не будет происходить в присутствии избытка ионов железа или марганца. Поэтому следует обратить особое внимание на приготовление среды.
3. Выделение отдельных колоний проводят для того, чтобы освободиться от фона родительских клеток. Такие родительские клетки способны расти на тех средах, которые будут использованы при проверке на ауксотрофность.
4. (Этап 5); содержащие искомые перестройки штаммы будут расти на среде Е + гистидин, но не на среде Е + гистидин + тетрациклин или на среде Е + гистидинол. Большинство таких перестроек будет делениями, но некоторые могут оказаться и инверсиями. В штамме TT513 инверсия с точкой разрыва внутри оперона, но дистальнее гена hisD должна привести к ауксотрофности по гистидину, но при этом должна сохраниться способность использовать гистидинол в качестве источника гистидина (hisD⁺).
5. (Этапы 7 и 8); эти скрещивания по картированию делений следует проводить так, как описано в эксперименте 7.
6. (Этапы 6 и 9); интерпретация результатов. В случае штамма TT513 (Tn10 вне промотора и оперона) любая деления, повреждающая промотор his-оперона, приведет к фенотипу His^- и к неспособности использовать гистидинол, даже если ген hisD и остается интактным. Полученные из клеток TT513 штаммы с инверсиями будут his-ауксотрофами, если точки разрыва попадают внутрь этого оперона. Если точка разрыва находится между промотором his-оперона и дистальным концом гена hisD, то они будут неспособны использовать гистидинол. Они могут использовать гистидинол лишь в том случае, если точка разрыва при образовании инверсии находится от промотора дистальнее гена hisD.

Если исходить из штамма со вставкой в гене hisC, то мутанты с делениями, распространяющимися на промотор (или удаляющими его), будут неспособны использовать гистидинол. Мутанты же с инверсиями, точки разрыва которых находятся между промотором his-оперона и дистальным в отношении промотора концом гена hisD, также будут неспособны использовать гистидинол.

При картирующих скрещиваниях делении не могут давать рекомбинантов с целым рядом последовательно расположенных точковых мутаций. Инверсии могут рекомбинировать со всеми точковыми мутациями, за исключением тех, которые расположены непосредственно рядом с точкой разрыва. Инверсии неспособны давать рекомбинантов His⁺ при скрещивании с делениями, удаляющими хотя бы одну из точек разрыва. Можете сами проверить эти утверждения, нарисовав соответствующие схемы.

Литература

Bochner B., Huang H.-C, Schieven G., Ames B. N., 1980. Positive selections for loss of tetracycline resistance, J. Bacterid., 143, 926.

Kleckner N., Reichart K., Botstein D., 1979. Inversions and deletions of the

Salmonella chromosome generated by the translocatable tetracyclineresistance element, J. Mol. Biol., 127, 89.

Ross D., Swan J., Kleckner N., 1979. Physical structures of Tn10-promoted

deletions and inversions, Role of 1400 bp inverted repetitions, Cell, 16, 721.