Эксперимент 4. Локализованный мутагенез

Введение

Когда известно положение изучаемого гена в хромосоме, часто бывает полезно уметь получать вблизи этого гена новые мутации. Как это сделать, предложили Хонг и Эймс (Hong, Ames, 1971). Они мутагенизировали суспензию фага P22, который осуществлял общую трансдукцию, и такой суспензией проводили трансдукцию, отбирая при этом те клетки, в которых ген донора встроился вблизи исследуемой области. Каждый встроившийся фрагмент хромосомы донора включает также и соседний сильно мутагенизированный сегмент хромосомы. Поэтому вероятность приобретения трансдуктантами мутаций в генах, тесно сцепленных с селектируемым маркером, оказывается высокой. Поскольку мутагеном обрабатывался лишь незначительный участок хромосомы в частице фага, то вероятность множественных мутаций оказывается гораздо ниже, чем при обычных методах мутагенеза. (Однако можно столкнуться с множественными мутациями в трансдуцируемой области.) Использование элементов лекарственной устойчивости расширяет границы применения этого метода. Избрав в качестве селектируемого маркера устойчивость к тетрациклину, можно сильно мутагенизировать область хромосомы вблизи любой вставки Tn10. Поскольку этот селектируемый маркер (т. е. устойчивость к тетрациклину) можно поместить рядом с любым интересующим нас геном (см. эксперимент 2), то такую методику можно применять в отношении любой области хромосомы.