Методика

Мутагенез области hisW

1. Отдельной колонией штамма LT2 засейте небольшой объем среды (3 мл). Культуру инкубируйте при 37°С со встряхиванием.

2. По чашке Е + тетрациклин + 2% глюкозы разотрите 0,1 мл клеток LT2 и 0,1 мл препарата фага, выращенного на штамме TT5371 (hisW⁺zeh-754 :: Tn10) и сильно мутагенизированного гидроксиламином (см. методику 8). Приготовьте 10 таких чашек и инкубируйте их при 30°С до тех пор, пока не станут видны крохотные (как острие булавки) колонии (т. е. в течение 12-18 ч). После этого перенесите чашки на 40°С и продолжайте инкубацию, пока большинство колоний не станут большими.

Идентификация мутантов

3. Поищите на чашках крохотные колонии (потенциальные температурочувствительные мутанты) и морщинистые колонии (потенциальные конститутивные мутанты hisW). Отберите уколом крохотные колонии и рассейте штрихом до отдельных колоний на чашках Green + тетрациклин + ЭГТА. Инкубируйте чашки при 30°С. Отберите уколом морщинистые колонии и рассейте их штрихом на чашки Е + тетрациклин + 2% глюкозы (по 6-8 рассевов на каждую чашку). Инкубируйте при 30°С.

Перепечатайте штрихи потенциальных температурочувствительных мутантов на три чашки Е + тетрациклин (10 мкг/мл)+ ЭГТА. Одну из этих чашек инкубируйте при 30°С, другую - при 37°С, а третью - при 41°С.

Со штрихов каждого потенциального конститутивного his-мутанта отберите уколом но слабоокрашенной морщинистой колонии и определите их чувствительность к фагу, а также сцепление фенотипа "морщинистые колонии" с устойчивостью к тетрациклину.

5. Посмотрите, как влияет температура на рост клеток на чашках-репликах. По возможности отберите уколом по две колонии со штриха каждого мутанта, рост которого четко подавляется при повышении температуры инкубации. Пересейте эти колонии штрихом на чашку со средой Green + тетрациклин. Инкубируйте чашки при 30°С.

Проверка фенотипа мутантов и их чувствительности к фагу

6. Из каждого штриха отберите уколом по бледноокрашенной (предположительно чувствительной к фагу) колонии. С помощью штампа отпечатайте их на главную чашку со средой Green + тетрациклин + ЭГТА. Эту главную чашку инкубируйте при 30°С.

7. Перепечатайте потенциальные температурочувствительные мутанты с главной чашки на чашки со средой Е. Одну чашку-реплику инкубируйте при 25°С (комнатная температура), а другие - при 30, 37 и 40°С.

8. Через 24 ч посмотрите, как выросли колонии на этих чашках. Вырастите в питательном бульоне при 30°С культуры всех независимых проверенных температурочувствительных мутантов и всех мутантов, образующих морщинистые колонии.

9. С помощью перекрестного штрихования проверьте чувствительность мутантов к фагу. Если есть время, то проверьте сцепление полученной мутации с Tn10.

10. Заложите культуры на хранение и занесите в журнал все проверенные температурочувствительные мутанты и все мутанты, образующие морщинистые колонии.