Обсуждение

1. (Этап 2); суспензию фага следует обрабатывать мутагеном так, чтобы сохранялось всего лишь около 0,1% бляшкообразующих единиц. Так как при этом практически все мутации, имеющиеся в популяции, были индуцированы мутагеном в свободных фаговых частицах, то все выявленные в скрещиваниях трансдуктанты с мутациями могут считаться результатом независимых актов мутагенеза. В этом эксперименте мы исходим из того, что температурочувствительные мутанты будут образовывать колонии при 30°С, но не будут продолжать расти после переноса чашки на высокую температуру. Поэтому после инкубации чашек при 40°С такие мутанты выявляются в виде крошечных колоний.
2. (Этап 3); все конститутивные his-мутанты образуют морщинистые колонии, если их выращивать на среде с высоким содержанием глюкозы (Murray, Hartman, 1972).
3. (Этап 4); чашки со стерильными пятнами перепечатывают на чашки-реплики, содержащие ЭГТА, чтобы предотвратить размножение фага и повысить вероятность выявления чувствительных к фагу нелизогенных рекомбинантов. Среда Green + тетрациклин + ЭГТА содержит 1% глюкозы и потому пригодна для выявления морщинистых колоний, образуемых конститутивными мутантами. Перепечатывая чашки со штрихами и просмотрев все изолированные колонии, можно обнаружить температурочувствительных мутантов даже в том случае, если в исходной колонии содержалось значительное количество ревертантов.
4. (Этап 5); повторный рассев до отдельных колоний проводится для того, чтобы очистить штамм от фага. Этот рассев проводят на чашках Green + тетрациклин без ЭГТА, что дает возможность разглядеть на них чувствительные к фагу колонии.
5. (Этап 7); чувствительность к температуре проверяют на минимальной среде, так как при этом получаются более четкие результаты. Это относится не ко всем мутантам, и чувствительность к температуре можно проверить и на богатой, и на бедной средах. Следует отметить, что в этом случае можно выявить также и температурочувствительные мутанты детерминанта устойчивости Tn10.

Литература

Anton D. N., 1968. Histidine regulatory mutants in Salmonella typhimurium. V. Two new classes of histidine regulatory mutants, J. Mol. Biol., 33, 533.

Brenchley J. E., Ingraham J. L., 1973. Characterization of a cold-sensitive hisW mutant of Salmonella typhimurium, J. Bacterid., 11, 452.

Hong J.-S., Ames B. N., 1971. Localization mutagenesis of any specific small region of the bacterial chromosome, Proc. Natl. Acad. Sci., 68, 3158.

Murray M. L., Hartman P. E., 1972. Overproduction of hisH- and hisF-gene products leads to inhibition of cell division in Salmonella, Clin. J. Microbiol., 1, 867.