Методика

1. Посейте LB-культуры штаммов со встроенными в хромосому элементами Tn10. Посейте также культуры (при 30°С) штаммов с эписомами F′_ts Tn10lac⁺ (TT627, TT628 и TT629).
2. Перенесите эписомы F′_ts в каждый из мутантов со случайной вставкой Tn10. Это можно сделать, нанеся капли культур на селективную чашку (NCE + лактоза). На одно место чашки нанесите каплю культуры реципиента, на другое - каплею культуры донора, а на третье - капли и той и другой культуры. После того как жидкость впитается, штрихом рассейте материал каждого пятна по своему сектору чашки. Это делается для того, чтобы из конъюгационной смеси получить отдельные колонии эксконъюгантов, а не просто зоны сплошного роста на месте нанесения капель. Инкубируйте чашки в течение 36-48 ч при 30°С.
3. Из пятна конъюгации отберите уколом несколько больших колоний. (В контрольных пятнах колоний быть не должно). Это и есть реципиенты, получившие плазмиду F′_ts lac⁺. Каждую из этих колоний рассейте штрихом на двух минимальных чашках NCE с лактозой. Одну чашку инкубируйте при 40°С, а другую - при 30°С.
4. Через 48 ч должен вырасти штрих на чашке, инкубируемой при 30°С. На той чашке, которая инкубировалась при 40°С, на месте штриха должно быть лишь несколько больших колоний. Это и есть искомые Hfr-клетки. Они являются Lac⁺ при той температуре (40°С), при которой невозможна автономная репликация эписомы F′_ts lac⁺. Как предполагается, гены lac⁺ эписомы F′, встроившись в хромосому, перестали быть чувствительными к температуре. Уколом отберите несколько таких предположительных Hfr-клеток и вырастите их культуры в жидкой селективной среде (NCE + 0,5% лактозы) при 40°С. Также посейте в LB (при 37°С) культуры ряда реципиентов, которые будут использоваться для картирования. Это единичные ауксотрофы, каждый из которых несет также мутацию устойчивости к стрептомицину. Нужно немного таких штаммов. Поэтому можно рискнуть и приготовить один набор реципиентных культур сразу на несколько групп. Чтобы сэкономить чашки, можно и контрольные чашки с реципиентами приготовить сразу на несколько групп.
5. Для картирования точек начал переноса Hfr-штаммов проведите скрещивания на чашках. В первых скрещиваниях штаммы донора и реципиента (по 0,1 мл каждого) высевайте прямо на селективную среду (E + стрептомицин). Инкубируйте чашки при 37°С.
6. Подсчитайте число рекомбинатов. Учитывайте положение на карте маркеров реципиентов. Таким способом можно определить направление переноса, но лишь приблизительное положение на карте точки начала переноса Hfr. Для более точного картирования возьмите самые близкие к точке начала переноса маркеры и используйте разведения донорной культуры. Для дальнейшего уточнения данных по картированию необходимо уже определять время вхождения маркера или проводить трехфакторные скрещивания.