НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика

  1. Посейте LB-культуры штаммов со встроенными в хромосому элементами Tn10. Посейте также культуры (при 30°С) штаммов с эписомами F′ts Tn10lac+ (TT627, TT628 и TT629).
  2. Перенесите эписомы F′ts в каждый из мутантов со случайной вставкой Tn10. Это можно сделать, нанеся капли культур на селективную чашку (NCE + лактоза). На одно место чашки нанесите каплю культуры реципиента, на другое - каплею культуры донора, а на третье - капли и той и другой культуры. После того как жидкость впитается, штрихом рассейте материал каждого пятна по своему сектору чашки. Это делается для того, чтобы из конъюгационной смеси получить отдельные колонии эксконъюгантов, а не просто зоны сплошного роста на месте нанесения капель. Инкубируйте чашки в течение 36-48 ч при 30°С.
  3. Из пятна конъюгации отберите уколом несколько больших колоний. (В контрольных пятнах колоний быть не должно). Это и есть реципиенты, получившие плазмиду F′ts lac+. Каждую из этих колоний рассейте штрихом на двух минимальных чашках NCE с лактозой. Одну чашку инкубируйте при 40°С, а другую - при 30°С.
  4. Через 48 ч должен вырасти штрих на чашке, инкубируемой при 30°С. На той чашке, которая инкубировалась при 40°С, на месте штриха должно быть лишь несколько больших колоний. Это и есть искомые Hfr-клетки. Они являются Lac+ при той температуре (40°С), при которой невозможна автономная репликация эписомы F′ts lac+. Как предполагается, гены lac+ эписомы F′, встроившись в хромосому, перестали быть чувствительными к температуре. Уколом отберите несколько таких предположительных Hfr-клеток и вырастите их культуры в жидкой селективной среде (NCE + 0,5% лактозы) при 40°С. Также посейте в LB (при 37°С) культуры ряда реципиентов, которые будут использоваться для картирования. Это единичные ауксотрофы, каждый из которых несет также мутацию устойчивости к стрептомицину. Нужно немного таких штаммов. Поэтому можно рискнуть и приготовить один набор реципиентных культур сразу на несколько групп. Чтобы сэкономить чашки, можно и контрольные чашки с реципиентами приготовить сразу на несколько групп.
  5. Для картирования точек начал переноса Hfr-штаммов проведите скрещивания на чашках. В первых скрещиваниях штаммы донора и реципиента (по 0,1 мл каждого) высевайте прямо на селективную среду (E + стрептомицин). Инкубируйте чашки при 37°С.
  6. Подсчитайте число рекомбинатов. Учитывайте положение на карте маркеров реципиентов. Таким способом можно определить направление переноса, но лишь приблизительное положение на карте точки начала переноса Hfr. Для более точного картирования возьмите самые близкие к точке начала переноса маркеры и используйте разведения донорной культуры. Для дальнейшего уточнения данных по картированию необходимо уже определять время вхождения маркера или проводить трехфакторные скрещивания.
предыдущая главасодержаниеследующая глава






Генетики нашли в ДНК мужчин следы древней «войны кланов»

Европейцы и азиаты посветлели независимо друг от друга

Современные высшие растения возникли в результате сдвига экспрессии генов

Генетики нашли «семью», состоящую из 13 миллионов человек

Прочитали рекордный по длине геном мексиканской амбистомы - 32 миллиарда пар нуклеотидных оснований

ДНК человека, умершего в 1827 году, восстановили без его останков

Генетики изучили жителей Новой Гвинеи

Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru