Обсуждение

I. См. методику 1.

II. 1. Количество фага и клеток, высеваемых на чашку, зависит от размера бляшек. Наиболее высокие титры препаратов получаются тогда, когда бляшки на чашке соприкасаются, давая сплошной лизис. Если бляшки сильно перекрываются, то клетки газона убиваются слишком рано, чашки получаются очень прозрачными, а выход фага - низким. Если бляшки не перекрываются, то заражено слишком мало клеток, что приводит к низкому выходу фага. Однако точное соотношение фага и клеток не имеет критического значения.

2. Инкубация фага и клеток в высоких концентрациях гарантирует хорошую адсорбцию.

3. Агар не следует охлаждать ниже 47°С, так как в противном случае он начнет затвердевать. Если же он окажется намного горячее, то погибнет много клеток. Если агар был расплавлен не полностью, то чашка после инкубации будет рябой и бляшки будут плохо различимы. Следует наливать в чашки тонкий слой нижнего агара. Он должен быть влажным, чтобы растущие бляшки соприкоснулись и получился сплошной лизис.

4. При инкубации чашек крышками вверх конденсат капает на газон, что помогает получению сплошного лизиса. Обычно мы инкубируем чашки в большом закрытом пластмассовом ящике, на дно которого уложены влажные бумажные полотенца.

III. 1. (Этапы 1 и 2); если урожай фага снимать с чашек до наступления сплошного лизиса или спустя несколько часов по его достижении, то получаются препараты с пониженным титром. Момент наступления сплошного лизиса зависит от размера бляшек, количества высеянных на чашку фага и клеток, а также от скорости роста клеток. В случае фага дикого типа при описанных выше условиях сплошной лизис наступает примерно через 6 ч. Если фаг образует мелкие бляшки, то это время может возрасти до 8 ч. Когда чашки охлаждают, верхний агар становится более твердым и уже не смещается при наслаивании жидкости. За ночь фаг из верхнего агара диффундирует в налитую на чашку жидкость.

2. (Этапы 3, 4 и 5); добавляют хлороформ, поскольку он убивает все клетки и предотвращает бактериальный рост при длительном хранении. Чтобы в хлороформе не накапливались продукты окисления, в него добавляют этиловый спирт [несколько капель на пинту (~0,5 дм³) хлороформа]. На этой стадии полученный с чашек препарат фага можно хранить. Если такие препараты поместить в герметически закрытые пробирки, их можно хранить в течение примерно 5 лет. Если из очищенного фага будете выделять ДНК, то работайте аккуратно и не захватите кусочков агара, который является мощным ингибитором многих ферментов, работающих на ДНК. Его не так просто удалить и при очистке в градиенте плотности CsCl, так как часть агара обладает той же плотностью, что и фаг, и характеризуется высоким коэффициентом седиментации. Если же выделяемый препарат фага будет все же загрязнен агаром, то часть этого агара можно удалить, проведя центрифугирование перед очисткой фага в градиенте плотности CsCl. Не центрифугируйте фаг дольше, чем это необходимо для осветления. При излишнем сжатии осадка частицы фага могут повредиться, что приведет к потерям ДНК

3. (Этап 6); если фаг не подвергался излишнему сжатию, то его очень легко суспендировать. Тем не менее Лучше оставить осадок фага набухать в жидкости в течение нескольких часов на холоду перед тем, как суспендировать его, применяя физическое воздействие. При втором, очень кратковременном центрифугировании удаляются остатки обломков клеток и агара, а фаг не теряется. Если из препарата будете выделять ДНК, а он загрязнен агаром, то проведение этапа 6 обязательно.