Обсуждение

1. Неочищенный агар сильно ингибирует большинство рестриктирующих эндонуклеаз и других ферментов, работающих на ДНК. Это ингибирующее действие может быть сульфонированными углеводородами. Выделяемая этим методом ДНК фага λ происходит как из частиц фага, так и из свободной, выделенной в среду ДНК. После расщепления эндонуклеазой ДНК E. coli распределяется при электрофорезе по всей полоске гелия. Это позволяет увидеть лишь полосы ДНК фага λ, которых в молярном отношении оказывается больше.
2. При охлаждении чашек повышается твердость агарозы. Это предотвращает суспендирование агарозы при наслаивании и сборе жидкости с чашек на следующем этапе. Фаг и фаговая ДНК диффундируют из верхнего слоя агарозы в наслоенную жидкость. При охлаждении чашек и использовании холодного буфера для разведения фага λ снижается также деградация ДНК после того, как она диффундирует в наслоенную жидкость.
3. С агарозной чашки, как и с обычной чашки, получается 4 мл препарата фага с титром 10¹⁰ частиц фага в 1 мл. В 0,4 ;мл такого препарата содержится столько фага и фаговой ДНК, сколько нужно примерно на десять полосок в геле.
4. Диэтилоксидиформат добавляют, чтобы инактивировать нуклеазы. На начальных этапах нуклеазы, по-видимому, ингибируются агарозой, так как при 37°С ДНК не деградирует до тех пор, пока ее вместе с наслоенной жидкостью не снимут с чашки.
5. ДСН денатурирует белки и приводит к выделению ДНК из фаговых частиц.
6. Трис добавляют для того, чтобы забуферить раствор, так как диэтилоксидиформат вызывает образование около 30 мМ CO₂. Na₂-ЭДТА добавляют, чтобы хелатировать ионы Mg²⁺ в буфере для разведения фага λ.
7. Смесь нагревают до полной денатурации белка.
8. Добавление ацетата калия приводит к выпадению осадка денатурированных белков с калиевой солью додецилсульфата. Ацетат калия добавляют перед тем, как охладить пробирки, в результате чего преципитат образуется медленнее и оказывается мельче. Такие преципитаты легче удалять с помощью центрифугирования.
9. Охлаждение обеспечивает полноту преципитации.
10. Если часть преципитата при центрифугировании не села на дно, то резко встряхните пробирку, чтобы удалить захваченный преципитатом воздух, и проведите повторное центрифугирование.
11. Постарайтесь не терять осадка. Если надосадочная жидкость оказалась мутной, то проведите повторное центрифугирование.
12. Высокомолекулярная ДНК в полученном препарате легко осаждается этанолом. Препарат не следует охлаждать, так как при низких температурах могут выпасть в осадок и нежелательные примеси.
13. (Этапы 13 и 14); ацетат калия очень хорошо растворим в этаноле, так что соль в осадок не выпадает. Для удаления растворимых примесей и ацетата калия важно, чтобы из пробирки стекла вся жидкость. Если жидкость из пробирки не стекает, ее можно удалить тонким кончиком фитиля из хлопчатобумажной ткани или ваты.
14. (Этап 15); РНКазу добавляют, чтобы удалить примесь РНК, которая может ингибировать многие ферменты, работающие на ДНК. Расщепленную РНК можно не удалять.

Литература

Cameron J. R., Philippsea P., Davis R. W., 1977. Analysis of chromosomal integration and deletions of yeast plasmids, Nucleic Acids Res.,. 4, 1429.