III. Выделение ДНК из термоиндуцибельных лизогенов Sam7

1. Рассейте лизогенные бактерии для получения отдельных колоний. Инкубируйте при 30-32°С.
2. Проверьте несколько колоний на рост при 32 и 42°С.
3. Отберите с чашки, выращенной при 32°С, такую колонию, которая не растет при 42°С. Вырастите ночную культуру в бульоне LB при 32°С.
4. Засейте 10 мл этой ночной культуры в 1000 мл бульона LB (рН 7,5-8).
5. Растите при 32°С до тех пор, пока A₆₀₀ не достигнет 0,6 (около 3-4 ч).
6. Нагрейте до 42-43°С и продолжайте выращивать при этой температуре в течение по крайней мере 15 мин.
7. Выращивайте при 37°С в течение еще 3 ч (поддерживайте рН в пределах 7,5-8; если среда закисляется, то добавьте NaOH).
8. Добавьте 5 мл СНС1з и встряхивайте 10 мин при 37°С (лизис наступает через несколько минут).
9. Центрифугируйте в роторе JA-7,5 (7000 об/мин, 5 мин), чтобы осадить обломки клеток.
10. Осадите фаг центрифугированием в роторе JA-7,5 (7000 об/мин, 15 ч).
11. Осадок фага ресуспендируйте в 9 мл 4 М CsCl (ρ=1,5), 10 мМ MgSO₄ и ОД мМ Na₂-ЭДТА.
12. Заполните две пробирки от ротора Beckman SW50.1. Центрифугируя при 30000 об/мин (20°С) в течение по крайней мере 16 ч, сконцентрируйте фаг в полосу.
13. Проколов пробирку сбоку иглой номер 25 от шприца для инъекций, отберите полосу фага. Из каждой пробирки отбирайте 0,5 мл.
14. Храните фаг в растворе CsCl при 4°С. (При длительном хранении ДНК лучше всего сохраняется в фаге.)

Хранение клеток. Вырастите ночную культуру при 32°С, добавьте диметилсульфоксид до 7% (по объему), храните ее замороженной при -70°С.