IV. Разделение цепей ДНК фага λ

А. Денатурирующий раствор

1. В полиалломерную пробирку от центрифуги Beckman размером ¹/₂×2 дюйма при 0°С внесите 1,0 ед. A₂₆₀ фага λ (50 мкг ДНК). (Максимальный объем 200 мкл; минимальное поглощение препарата A₂₆₀=5,0.)
2. Добавьте 200 мкл H₂O (минус объем фага).
3. Добавьте 5 мкл 1 М Na₄-ЭДТА.
4. Добавьте 5 мкл 4%-ного раствора N-лауроилсаркозината натрия в 10^-2 М трис (рН 7,5).
5. Добавьте 35 мкл 1 М NaOH.
6. Оставьте на 10-30 мин при комнатной температуре.

Б. Раствор для закаливания

1. Налейте 40 мкл 2М трис-HCl в пробирку от микрофуги на 1,5 мл.
2. Добавьте 1 ед. A₂₆₀ poly(rUG) (например, 7 мкл раствора с A₂₆₀=175) в H₂O.
3. Добавьте 245 мкл H₂O (минус объем poly (rUG)). Суммарный объем растворов А и Б равен 0,530 мл.
4. Поместить оба раствора (А и Б) в лед и охладите до 0°С. Пользуясь автоматической пипеткой, впрысните раствор для закаливания (Б) и раствор ДНК (А) в полиалломерной пробирке, помещенной в смеситель Vortex, включенный на положение 3. Перенесите пробирку обратно в лед.

В. Добавьте 2,13 мл 7,29 М CsCl (ρ²⁵=1,91; η²⁵=1,4188). Центрифугирование: 30000 об/мин в роторе Beckman SW50.1 при 10°С в течение 48 ч.

Фракционирование: фракции по 8 капель, всего 40 фракций.

Литература

Davis R. W., Hyman R. W., 1971. A study in evolution: The DNA base sequence homology between coliphages T1 and T3, J. Mol. Biol, 62, 287.

Summers W. C., Szybalski W., 1968. Totally asymmetric transcription of coliphage T7 in vivo: Correlation with polyG binding sites, Virology, 34,9.