Методика 12. Выделение плазмидной и бактериальной ДНК

I. Выделение больших количеств плазмидной ДНК из E. coli

1. Начинайте с отдельной колонии E. coli, проверенной на наличие плазмиды (Tet^R, Amp^R, Cam^R и т. п.). В колбе на 1 л вырастите при интенсивном встряхивании до насыщения 100 мл культуры в бульоне LB. Выход составляет ~50 мкг. Приведенная ниже методика выделения рассчитана на одну пробирку от ротора SW50.1. (Объемы при использовании центрифужных пробирок для других роторов).
2. Осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 8000 об/мин и 5°С.
3. Ресуспендируйте клетки в ¹/₄ объема 10 мМ трис (рН 8,5) и 1 мМ Na₃-ЭДТА. Вновь осадите клетки центрифугированием.
4. Ресуспендируйте клетки в 2 мл 15%-ного раствора сахарозы, 0,05 М трис (рН 8,5) и 0,05 М Na₂-ЭДТА, содержащего 1 мг/мл свежерастворенного лизоцима. Перенесите в центрифужную пробирку на 10 мл, которую можно центрифугировать при 20000 об/мин. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-60 мин.
5. Добавьте 2 мл раствора тритона (0,1% тритона X-100 (Sigma), 0,05 трис (рН 8,5) и 0,05 М Na₂-ЭДТА). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-20 мин. Если клетки не лизируют и суспензия не станет очень вязкой, то инкубируйте 30 мин при 37°С.
6. Центрифугируйте в течение 1 ч в роторе JA-21 при 20000 об/мин и 5°С.
7. Наклоняя пробирку, сливайте надосадочную жидкость в мерную аналитическую пробирку до тех пор, пока не дойдете до очень вязкого материала над осадком. Обычно этот вязкий материал занимает менее последнего сантиметра осветленной надосадочной жидкости. Иногда оказывается, что надосадочная жидкость невязкая вся вплоть до самого осадка. В таком случае соберите ее всю.
8. Доведите объем до 4,0 мл. Добавьте 3,7 г сухого CsCl и 0,4 мл раствора 10 мг/мл бромистого этидия (Sigma). Показатель преломления должен находиться между 1,390 и 1,396, а плотность должна быть равна 1,59 г/мл. Плотность является более надежным показателем и ее легко определить, взвесив известный объем жидкости. Получившаяся в результате смесь как раз заполнит одну пробирку от ротора SW50.1.
9. Центрифугируйте в течение 48 ч при 35 000 об/мин и 20°С.
10. Если осветить пробирку длинноволновым УФ-светом, то можно увидеть полосы. Нижняя полоса содержит ковалентно-замкнутую кольцевую ДНК. Проткнув пробирку сбоку иглой номер 20 или 21 от шприца для инъекций, отберите ДНК.

Релаксированная ДНК; ρ=1,55 г/мл

Нативная суперализованная ДНК: ρ=1,59 г/мл

При выделении из больших объемов культуры используйте угловые роторы или роторы с вертикальным расположением пробирки