Обсуждение

1. При длительном хранении на чашках, в столбиках или в бульоне клетки E. coli теряют многие плазмиды, даже мультикопийные. Поэтому целесообразно непосредственно перед тем, как проводить выделение больших количеств плазмидной ДНК, проверить присутствие плазмиды. Однако, чтобы гарантировать поддержание плазмиды в этой культуре, не обязательно выращивать культуру, из которой будете выделять плазмиду, в присутствии используемого для отбора питательного вещества или лекарственного препарата.
2. (Этапы 2 и 3); эти этапы нужны для того, чтобы отмыть клетки от культуральной среды и других растворимых соединений (Mg²⁺, солей, буферов и т. п.), которые могут мешать на следующих этапах.
3. (Этап 4); Na₂-ЭДТА используется для удаления ионов Ca²⁺ из клеточной стенки, что делает ее более восприимчивой к действию лизоцима. Лизоцим довольно неустойчив при щелочных значениях рН, и поэтому рекомендуется пользоваться свежеприготовленным раствором. При рН 4-5 лизоцим стабилен в течение нескольких недель при 5°С, а при комнатной температуре - в течение нескольких дней. Этот фермент следует растворять в холодной дистиллированной воде.
4. (Этап 5); тритон X-100 представляет собой неионный детергент и вызывает лизис обработанных лизоцимом клеток. При этом основная часть клеточной ДНК остается связанной с обломками клеток и при центрифугировании оказывается в осадке. Чтобы эта клеточная ДНК не вышла в раствор, нужно соблюдать осторожность и не слишком интенсивно перемешивать.
5. (Этап 6); осадок получается несколько студенистым, а надосадочная жидкость - желтоватой. Если надосадочная жидкость оказывается прозрачной и бесцветной, а осадок - компактным и непрозрачным, то значит, клетки не лизировали. Если получилось именно так, то ресуспендируйте осадок, прогрейте пробирку в течение 30 мин при 65°С и повторите этап 6.
6. (Этап 7); плазмидная ДНК должна быть освобождена из обломков клеток и должна находиться в надосадочной жидкости. Вязкий материал представляет собой, по-видимому, клеточную ДНК. Желательно, чтобы его попало в сливаемую жидкость как можно меньше.
7. (Этап 8); большинство препаратов CsCl влажные, и поэтому следует установить эмпирическим путем, сколько добавлять невысушенного CsCl.
8. (Этап 9); при равновесном центрифугировании ДНК собирается в полосу примерно за 48 ч. Однако, для того чтобы РНК достигла своей равновесной полосы, необходимо больше времени. Поэтому чем дольше длится центрифугирование, тем меньше в получаемом препарате ДНК оказывается примеси РНК.
9. (Этап 10); используется длинноволновый ультрафиолет, так как облучение коротковолновым УФ-светом приводит к образованию в ДНК тиминовых димеров и поперечных сшивок.