Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. А. Быстрый метод выделения плазмидной и (или) бактериальной ДНК из колоний или жидких культур

  1. Пользуясь плоскими зубочистками, соскребите колонии с агарозных чашек в центрифужные пробирки на 1,5 мл. Если исходите из жидкой культуры, то отцентрифугируйте 0,1 мл культуры, выросшей до насыщения. Ресуспендируйте осадок в 0,5 мл раствора: 50 мМ трис (рН 8,5), 50 мМ Na2-ЭДТА, 15% сахарозы, 1 мг/мл лизоцима (добавляется непосредственно перед использованием).
  2. Оставьте на 10 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте 1 мкл диэтилоксидиформата при комнатной температуре.
  4. Добавьте 10 мкл 10%-ного раствора ДСН. Перемешайте, перевертывая пробирку.
  5. Для получения бактериальной ДНК прогрейте в течение 5 мин при 70°С под крышкой. При выделении только плазмидной ДНК препарат не прогревайте.
  6. Добавьте 50 мкл 5 М ацетата калия.
  7. Охладите пробирки и держите их во льду в течение по крайней мере 30 мин.
  8. Осадите преципитат центрифугированием в микрофуге в течение 15 мин.
  9. Надосадочную жидкость слейте в новую пробирку.
  10. Долейте пробирку доверху этиловым спиртом при комнатной температуре.
  11. Осадите преципитат центрифугированием в микрофуге в течение 5 мин.
  12. Слейте надосадочную жидкость. Переверните пробирку и поставьте ее на бумажное полотенце, чтобы жидкость стекла из нее. Должна стечь вся жидкость. Ее можно также выпарить, но нельзя пересушить осадок.
  13. Растворите выпавшую в осадок ДНК в 50 мкл раствора: 10 мМ трис (рН 7,5), 1 мМ Na3-ЭДТА, 10 мкг/мл РНКазы А.

Полученного количества ДНК обычно достаточно для двух нанесений на гель. Суперспирализованную ДНК после этапа 13 можно прямо использовать для электрофореза в геле. Все процедуры можно проводить при комнатной температуре, за исключением этапа 7. На этом этапе необходима длительная инкубация при 0°С, а также длительное центрифугирование, чтобы осадить все обломки клеток и преципитат комплекса белка с додецилсульфатом калия.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"