Обсуждение

1. (Этапы 1 и 2); неочищенный агар сильно ингибирует активность большинства рестриктирующих эндонуклеаз и других ферментов, работающих на ДНК. Этим ингибитором, возможно, являются содержащиеся в нем сульфонированные углеводороды. При соскребывании колоний с обычных чашек с агаром иногда можно захватить столько этого ингибитора, что на выделенной ДНК не смогут работать ферменты. При использовании чашек с агарозой таких осложнений не возникает. Не обязательно использовать всю колонию. Обычно для выделения достаточно примерно одной четверти колонии.
2. (Этап 3), диэтилоксидиформат добавляют, чтобы инактивировать нуклеазы. Если нужна биологически активная ДНК, то этот этап следует опустить.
3. (Этап 4), ДСН лизирует сферопласты и денатурирует белки.
4. (Этап 5), при нагревании длинная бактериальная ДНК высвобождается из других больших клеточных компонентов и уже не осаждается при центрифугировании на этапе 8.
5. (Этап 6); ацетат калия используется для осаждения додецилсульфата и комплексов белков с додецилсульфатом. Что бы преципитаты образовывались медленно, ацетат калия следует добавлять до того, как охлаждать пробирки.
6. (Этап 7); для полного осаждения додецилсульфата калия достаточно охладить пробирки и держать их на холоду в течение 30 мин.
7. (Этап 8); если преципитат додецилсульфата калия образуется слишком быстро, то он может оказаться хлопьевидным или захватить пузырьки воздуха. В результате могут возникнуть трудности с его осаждением. Чтобы полностью осадить додецилсульфат калия, достаточно центрифугирования в течение 15 мин. Если же преципитат все-таки остался в надосадочной жидкости, то перенесите ее в новую пробирку, энергично встряхните и повторите этап 8.
8. (Этап 9); не выбрасывайте преципитат. Если надосадочная жидкость оказалась мутной, то просто повторите центрифугирование.
9. (Этапы 10 и 11); препарат содержит ДНК и РНК. Он легко осаждается этиловым спиртом. Охлаждать препараты не следует, так как при пониженных температурах может происходить преципитация нежелательных примесей.
10. (Этап 12); ацетат калия очень хорошо растворим в этаноле, так что соль в осадок не выпадет. Чтобы удалить растворимые примеси и ацетат калия, нужно слить всю жидкость. В этих же целях можно сполоснуть пробирки 70%-ным этанолом. Если жидкость не стекает с пробирки, ее можно промокнуть фитилем из ткани или ваты, не касаясь осадка ДНК.
11. (Этап 13); РНКазу используют, чтобы удалить примесь РНК, которая может подавлять активность ферментов, работающих на ДНК. Гидролизованную РНК удалять необязательно.
12. (Этап 14); иногда выделенная таким способом ДНК не расщепляется рестриктирующими эндонуклеазами. В таком случае ее можно дополнительно очистить, проведя второе осаждение этанолом. Добавьте 200 мкл 10 мМ трис (рН7,5), 1 мМ. Na₃-ЭДТА и 50 мкл 5 М ацетата калия. Если при этом образовался преципитат, то отцентрифугируйте его и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Добавьте 0,5 мл этанола и поместите на 20 мин в лед. Так как РНК уже удалена из препарата, то ДНК преципитирует хуже. Повторите этапы 11, 12 и 13.