Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Б. Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из 10 мл жидкой культуры

  1. Вырастите клетки до насыщения в 10 мл бульона LB с 0,4% глюкозы. Если необходимо, то добавьте используемый для отбора лекарственный препарат.
  2. Отцентрифугируйте клетки прямо в той пробирке, в которой выращивали культуру, или в центрифужной пробирке на 10 мл. Ресуспендируйте осадок в 1,4 мл 10 мМ трис (рН 8,5) и 1 мМ Na3-ЭДТА.
  3. Перенесите суспензию клеток в пробирку от микрофуги на 1,5 мл и центрифугируйте в течение 30 с.
  4. Ресуспендируйте в 0,4 мл раствора, содержащего 15% сахарозы, 50 мМ трис-HCl и 50 мМ Na2-ЭДТА (рН 8,5). Тщательно перемешайте в смесителе Vortex.
  5. Поместите в лед и добавьте 0,1 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 5 мг/мл в приведенном выше буфере при 0°С.
  6. В течение 10 мин держите во льду, периодически осторожно переворачивая пробирку.
  7. Добавьте 0,3 мл раствора, содержащего 0,1% тритона X-100, 50 мМ трис-HCl и 50 мМ Na2-ЭДТА (рН 8,5) при 0°С.
  8. В течение 10 мин держите пробирку во льду, периодически осторожно переворачивая.
  9. Центрифугируйте в течение 2 мин в микрофуге, помещенной в холодную комнату.
  10. Слейте надосадочную жидкость в новую пробирку от микрофуги.
  11. Добавьте 2 мкл диэтилоксидиформата, перетрясите.
  12. Прогрейте в течение 15 мин при 70°С, 15 мин подержите во льду, после чего центрифугируйте в течение 2 мин в микрофуге.
  13. Слейте надосадочную жидкость в новую пробирку от микрофуги.
  14. Долейте пробирку доверху этанолом при комнатной температуре.
  15. Осадите преципитат, центрифугируя 5 мин в микрофуге.
  16. Слейте надосадочную жидкость. Пробирку переверните на бумажное полотенце, чтобы дать жидкости стечь. Вся жидкость должна стечь. Ее можно выпарить, но нельзя пересушить осадок.
  17. Растворите осадок ДНК в 50 мкл раствора: 10 мМтрис (рН 7,5), 1 мМ Na3-ЭДТА, 10 мкг РНКазы А.

На полосу агарозного геля достаточно наносить 5 мкл такого препарата. Полученная таким способом ДНК расщепляется большинством ферментов рестрикции.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"