Обсуждение

ДНК вектора и встраиваемую ДНК расщепляют по отдельности, так как важно добиться такого расщепления векторной ДНК, чтобы нерасщепленной осталось около одной молекулы ДНК фага λ на 10⁴ расщепленных молекул. Легко получить препарат ДНК фага λ, не загрязненный ингибиторами эндонуклеаз. В то же время многие препараты клеточной ДНК содержат такие ингибиторы. Если проводить совместное расщепление клеточной и фаговой ДНК, то присутствие ингибитора в препарате клеточной ДНК приведет к тому, что вероятность нерасщепленной ДНК фага λ окажется выше, чем 10^-4. Чтобы получить заведомо полное расщепление, нужно брать эндонуклеазы больше, чем это было определено на этапе 3. Этот этап имеет существенное значение только для векторной ДНК фага λ. Присутствие 10^-4 нерасщепленной ДНК фага λ нельзя обнаружить по результату электрофореза в геле, но легко выявить по инфекционности. Для более высокой эффективности упаковки in vitro липкие концы ДНК фага λ должны быть соединены, а для более эффективной трансфекции они должны оставаться свободными. Энергия активации соединения липких концов ДНК фага λ высока, и потому для их эффективного соединения необходима высокая температура (50°С). При 0°С соединение липких концов ДНК фага λ происходит крайне медленно. Поэтому липкие концы, образующиеся под действием рестриктирующей эндонуклеазы, можно полностью соединить, не соединив в то же время липких концов ДНК фага λ (разд. II). Скорость соединения, катализируемого ДНК-лигазой фага Т4 прямо пропорциональна концентрации лигазы. Поэтому используют высокие концентрации этого фермента. При рекомендуемых концентрациях лигазы реакция завершается за несколько минут. Рекомендуемых 1-6 ч хватает с избытком, однако вреда этот избыток не причинит.

Основой флуктуационного теста Луриа-Дельбрюка служит знаменитое распределение Пуассона (Poisson distribution) независимо от того имеют ли дело с мутантами бактерий или с мутантами рыб [Genetics, 28, 491-511 (1943)]. Рыб разглядеть легче, но разложить их по ячейкам сложнее, если, конечно вы не птица