Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

II. Получение индуцированных упаковывающих клеток

1. Штаммы бактерий 
А: N 205 recA- (λimm 434 cI-ts b2 red 3 Eam 4 Sam7) 
Б: N 205 recA- (λimm 434 cI-ts b2 red3 Dam4 Sam7) 
2. Рассейте каждый из этих штаммов штрихом до отдельных колоний. Чашки инкубируйте при 25-30°С. 
3. Проверьте рост нескольких колоний при 30 и 42°С. 
4. С чашки, выращенной при 30°С, отберите уколом по одной такой колонии этих штаммов, которая не растет при 42°С. 
5. Суспендируйте колонию каждого из этих штаммов в 200 мл бульона LB (30°С). Выращивайте клетки при 30°С до A600=0,3. 
6. Проведите индукцию обеих культур, инкубируя их в течение 15 мин при 42-43°С. 
7. Инкубируйте 3 ч при 37°С. 
8. Проверьте индукцию, отобрав из каждой культуры пробы по 1 мл. Добавьте в эти пробы по капле CHCl3, инкубируйте в течение 5 мин при 37°С. Культура в пробе должна лизировать. 
9. Слейте вместе обе эти культуры объемом по 200 мл. Осадите клетки, центрифугируя в течение 10 мин при 5000 об/мин. 
10. Ресуспендируйте в 40 мл холодного буфера для разведения фага λ. Отцентрифугируйте 10 мин при 5000 об/мин. 
11. Ресуспендируйте в 10 мл буфера для упаковки: 
    0,04 М трис (рН 8), 
    0,01 М MgSO4, 
    0,01 М спермидин-3HCl, 
    0,01 М путресцин-2HCl, 
    0,1% β-меркаптоэтанол 
    7% ДМСО.
12. Центрифугируйте 5 мин при 5000 об/мин. 
13. Ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для упаковки. Разлейте объемами по 20 мкл в полипропиленовые центрифужные пробирки на 0,5 мл. 
14. Заморозьте в жидком азоте и храните при -70°С. Можно хранить несколько месяцев.

Литература

Hohn B., Murray K., 1977. Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 3259.

Sternberg N., Tiemeier D., Enquist L., 1977. In vitro packaging of a λDam vector containing EcoRI DNA fragments of E. coli and phage PI, Gene, 1, 255.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"