Методика 29. Выделение ферментных препаратов из клеток, лизогенных по фагу λcI857 Sam7

I. Методики, общие для всех ферментов

А. Выращивание клеток и индукция

Вырастите клетки в бульоне LB или в среде с дрожжевым экстрактом Ardamine Z и Cerelose Bl (Panasenko et al., 1978). Клетки выращивайте при 30°С до мутности А₆₀₀=0,6 (при усиленной аэрации можно выращивать до мутности 1,0). В течение 15-20 мин прогрейте культуру при 42°С, а затем выращивайте еще в течение 2,5-3 ч при 37°С. Следите за тем, чтобы в процессе роста поддерживалось рН>7.

Б. Сбор клеток

Осадите клетки центрифугированием, взвесьте пастообразный осадок клеток. Ресуспендируйте клетки в 1/100 исходного объема раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5) и 10% сахарозы. Заморозьте, опустив в жидкий азот, и храните при температуре -70°С.

В. Лизис

Используйте методику лизиса в тепле (Scott and Korn-berg, 1978). Дайте клеткам оттаять и добавьте такое количество раствора триса с сахарозой, чтобы на 1 л лизирующего буфера приходилось 150 г клеток. При этом оставьте место, чтобы можно было добавить

сульфат аммония до 5% насыщения,
спермидин-Cl3 до 20 мМ,
Na2-ЭДТА до 20 мМ,
ДТТ до 1 мМ.

Сухим или 2М трис-основанием доведите рН до 8. Добавьте лизоцим до концентрации 0,2 мг/мл и инкубируйте во льду в течение 30 мин. Для достижения полного лизиса прогревайте порциями по 250 мл в водяной бане на 37°С в течение 5 мин (температура препарата при этом возрастет не до 37°С, а всего лишь примерно до 15°С).

Лизат центрифугируйте в течение 3 ч при 20000 об/мин в роторе JA-20, в течение 90 мин при 25000 об/мин в роторе SW-27 или в течение 60 мин при 40000 об/мин в роторе 60 Ti или 45 Ti.

Литература

Panasenko S. M., Alazard R. J., Lehman I. R., 1978. A simple threestep procedure tor the large scale purification of DNA ligase from a hybrid λ lysogen constructed in vitro, J. Biol. Chem., 253, 4590.

Scott J. F., Kornberg A., 1978. Purification of the rep protein of Escherichia coli, J. Biol. Chem., 253, 3292.