НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Методика 29. Выделение ферментных препаратов из клеток, лизогенных по фагу λcI857 Sam7

I. Методики, общие для всех ферментов

А. Выращивание клеток и индукция

Вырастите клетки в бульоне LB или в среде с дрожжевым экстрактом Ardamine Z и Cerelose Bl (Panasenko et al., 1978). Клетки выращивайте при 30°С до мутности А600=0,6 (при усиленной аэрации можно выращивать до мутности 1,0). В течение 15-20 мин прогрейте культуру при 42°С, а затем выращивайте еще в течение 2,5-3 ч при 37°С. Следите за тем, чтобы в процессе роста поддерживалось рН>7.

Б. Сбор клеток

Осадите клетки центрифугированием, взвесьте пастообразный осадок клеток. Ресуспендируйте клетки в 1/100 исходного объема раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5) и 10% сахарозы. Заморозьте, опустив в жидкий азот, и храните при температуре -70°С.

В. Лизис

Используйте методику лизиса в тепле (Scott and Korn-berg, 1978). Дайте клеткам оттаять и добавьте такое количество раствора триса с сахарозой, чтобы на 1 л лизирующего буфера приходилось 150 г клеток. При этом оставьте место, чтобы можно было добавить

сульфат аммония до 5% насыщения,
спермидин-Cl3 до 20 мМ,
Na2-ЭДТА до 20 мМ,
ДТТ до 1 мМ.

Сухим или 2М трис-основанием доведите рН до 8. Добавьте лизоцим до концентрации 0,2 мг/мл и инкубируйте во льду в течение 30 мин. Для достижения полного лизиса прогревайте порциями по 250 мл в водяной бане на 37°С в течение 5 мин (температура препарата при этом возрастет не до 37°С, а всего лишь примерно до 15°С).

Лизат центрифугируйте в течение 3 ч при 20000 об/мин в роторе JA-20, в течение 90 мин при 25000 об/мин в роторе SW-27 или в течение 60 мин при 40000 об/мин в роторе 60 Ti или 45 Ti.

Литература

Panasenko S. M., Alazard R. J., Lehman I. R., 1978. A simple threestep procedure tor the large scale purification of DNA ligase from a hybrid λ lysogen constructed in vitro, J. Biol. Chem., 253, 4590.

Scott J. F., Kornberg A., 1978. Purification of the rep protein of Escherichia coli, J. Biol. Chem., 253, 3292.

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru