II. Очистка ДНК-полимеразы I из лизата клеток E. coli 594 (см. список штаммов)

А. Фракционирование

К надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония в концентрации 5% от насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,25 г/мл). Помешивайте 1 ч при 4°С, после чего центрифугируйте в течение 30 мин при 10000 об/мин в роторе JA-14. Осадок отбросьте. К надосадочной жидкости, которая содержит сульфат аммония в концентрации 47% от насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,16 г/мл), перемешайте и центрифугируйте (Richardson et al., 1964). Осадок ресуспендируйте в буфере, содержащем 200 мМ NaPO₄ (рН 6,5) и 1 мМ ДТТ. Разведите так, чтобы ионная сила раствора стала приемлемой, и пропустите его в этом же буфере через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE-52 (объемом 0,5-1,0 мл на 1 г клеток).

Б. Хроматография на фосфоцеллюлозе

То, что протекло через ДЭАЭ-целлюлозу DE-52, диализуйте против 20 мМ KPO₄ (рН 6,5) и 1 мМ ДТТ. Нанесите на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 (объемом 0,5-1,0 мл на 1 г клеток), уравновешенной тем же буфером. Промойте таким количеством буфера 20 мМ, который равен объему колонки, а затем таким же количеством буфера 50 мМ KPO₄ и 1 мМ. ДТТ. Элюируйте градиентом концентрации буфера 50-250 мМ (с 1 мМ ДТТ). Элюируйте объемом, равным 7-8 объемам колонки. Объедините пиковые фракции (пик белка в середине градиента) и осадите сульфатом аммония (85% насыщения, или 0,6 г/мл). Осадок ресуспендируйте в таком объеме 100 мМ KPO₄ (рН 7,0), чтобы концентрация белка составила 10 мг/мл.

В. Хроматография на сефадексе G-100

Набейте колонку с сефадексом G-100, (объем сефадекса в колонке должен быть ≥25 объемов наносимого образца). Уравновесьте сефадекс буфером для колонки (100 мМ KPO₄ рН 7,0). Нанесите образец и следом пустите буфер для колонки. Объедините пиковые фракции. Пик должен элюироваться сразу же после исключенного объема. При желании можно сконцентрировать препарат, как было описано выше. Препараты храните замороженными при -70°С в том виде, как они были элюированы с последней колонки (Jovin et al., 1969). Небольшой объем можно хранить примерно в течение года при -20°С, добавив равный объем глицерина.

Г. Определение активности

Проба для определения активности содержит 50 мМ трис (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл активированной (обработанной ультразвуком) ДНК тимуса теленка или спермы лосося, по 20 мкМ каждого dNTP и около 100000 имп./мин α-³²P-dCTP или dGTP. Одна единица фермента соответствует включению примерно 10% метки в кислотонерастворимый материал за 3 мин при 37°С в пробе объемом 100 мкл. (1 ед. активности дает включение 10 моль за 30 мин, с поправкой на нуклеотидный состав.) При таком способе определения активности чистый фермент обладает удельной активностью около 2500 ед./мг.

Литература

Jovin T. M., England P. T., Bertsch L. L., 1969. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid,, J. Biol. Chem., 244, 2996.

Richardson C. C., Schildkraut C. L., Vasken Aposhian H., Kornberg A., 1964. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 39, 222.