НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

III. ДНК-лигаза фага T4 из лизата клеток E. coli E1150 (см. список штаммов)

А. Фракционирование

К надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония в концентрации 5% от насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,33 г/мл). Помешивайте на холоду в течение 1ч, центрифугируйте 30 мин при 10000 об/мин в роторе JA-14. Ресуспендируйте осадок в буфере, содержащем 25 мМ трис (рН 7,2), 0,3 М NaCl и 1 мМ ДТТ. Разведите таким образом, чтобы ионная сила соответствовала 0,3 М NaCl и пропустите через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE-52 (0,5-1,0 мл смолы на 1 г клеток) в этом же буфере.

Б. Фракционирование на P-11 и DE-52

Диализуйте препарат против буфера, содержащего 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ. Нанесите образец на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 (0,5-1,0 мл смолы на 1 г клеток), уравновешенной этим же буфером. Промойте колонку таким количеством этого буфера, который равен двум объемам колонки. Промойте буфером + 0,15 М NaCl в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте буфером с 0,75 М NaCl. Белок, элюированный с колонки, диализуйте против буфера, содержащего 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ. Выпавший при диализе белковый осадок отцентрифугируйте и отбросьте. Препарат нанесите на колонку с DE-52 (0,5 мл смолы на 1 г клеток), промойте буфером 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте этим же буфером плюс 0,3 М NaCl.

В. Хроматография на гидроксилапатите

Элюат с DE-52 прямо наносите на колонку с гидроксилапатитом (0,5 мл смолы на 1 мг белка), уравновешенным буфером, содержащим 25 мМ трис (рН 7,2), 1 мМ ДТТ и 0,3 М NaCl. Промойте этим буфером в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте градиентом концентрации сульфата аммония 0-0,5 М в буфере с 0,3 М NaCl. Лигаза (>95% чистоты) выходит в единственном основном белковом пике.

Г. Определение активности

Удобный, но отнюдь не количественный метод определения активности лигазы состоит в том, что замыкаются в кольца небольшие кольцевые молекулы ДНК, расщепленные такой рестриктирующей эндонуклеазой, которая приводит к образованию липких концов и которая свободна от примеси фосфатазы и экзонуклеазы. Более традиционные методы тестирования активности описаны в приведенных ниже работах (Weiss et al., 1968; Modrich and Lehman, 1970). По-видимому, с помощью большинства методов нельзя правильно определить активность лигазы до тех пор, пока препарат не будет первый раз очищен на DE-52. После очистки на P-11 активность препарата можно правильно определить уже любым способом.

Литература

Modrich P., Lehman I. R., 1970. Enzymatic joining of polynucleotides. J. Biol. Chem., 245, 3626.

Weiss B., Jasquemin-Sablan A., Live T. R., Fareed G. C., Richardson C. C., 1968. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 243, 4543.

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru