III. ДНК-лигаза фага T4 из лизата клеток E. coli E1150 (см. список штаммов)

А. Фракционирование

К надосадочной жидкости, содержащей сульфат аммония в концентрации 5% от насыщения, добавьте сухой сульфат аммония (0,33 г/мл). Помешивайте на холоду в течение 1ч, центрифугируйте 30 мин при 10000 об/мин в роторе JA-14. Ресуспендируйте осадок в буфере, содержащем 25 мМ трис (рН 7,2), 0,3 М NaCl и 1 мМ ДТТ. Разведите таким образом, чтобы ионная сила соответствовала 0,3 М NaCl и пропустите через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE-52 (0,5-1,0 мл смолы на 1 г клеток) в этом же буфере.

Б. Фракционирование на P-11 и DE-52

Диализуйте препарат против буфера, содержащего 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ. Нанесите образец на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 (0,5-1,0 мл смолы на 1 г клеток), уравновешенной этим же буфером. Промойте колонку таким количеством этого буфера, который равен двум объемам колонки. Промойте буфером + 0,15 М NaCl в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте буфером с 0,75 М NaCl. Белок, элюированный с колонки, диализуйте против буфера, содержащего 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ. Выпавший при диализе белковый осадок отцентрифугируйте и отбросьте. Препарат нанесите на колонку с DE-52 (0,5 мл смолы на 1 г клеток), промойте буфером 25 мМ трис (рН 7,2) и 1 мМ ДТТ в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте этим же буфером плюс 0,3 М NaCl.

В. Хроматография на гидроксилапатите

Элюат с DE-52 прямо наносите на колонку с гидроксилапатитом (0,5 мл смолы на 1 мг белка), уравновешенным буфером, содержащим 25 мМ трис (рН 7,2), 1 мМ ДТТ и 0,3 М NaCl. Промойте этим буфером в количестве, равном двум объемам колонки. Элюируйте градиентом концентрации сульфата аммония 0-0,5 М в буфере с 0,3 М NaCl. Лигаза (>95% чистоты) выходит в единственном основном белковом пике.

Г. Определение активности

Удобный, но отнюдь не количественный метод определения активности лигазы состоит в том, что замыкаются в кольца небольшие кольцевые молекулы ДНК, расщепленные такой рестриктирующей эндонуклеазой, которая приводит к образованию липких концов и которая свободна от примеси фосфатазы и экзонуклеазы. Более традиционные методы тестирования активности описаны в приведенных ниже работах (Weiss et al., 1968; Modrich and Lehman, 1970). По-видимому, с помощью большинства методов нельзя правильно определить активность лигазы до тех пор, пока препарат не будет первый раз очищен на DE-52. После очистки на P-11 активность препарата можно правильно определить уже любым способом.

Литература

Modrich P., Lehman I. R., 1970. Enzymatic joining of polynucleotides. J. Biol. Chem., 245, 3626.

Weiss B., Jasquemin-Sablan A., Live T. R., Fareed G. C., Richardson C. C., 1968. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 243, 4543.