X.1.1. Обнаружение и количественный учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутации у дрозофилы. Методы меллер-5 и ClD

С помощью названных методов можно проводить количественный учет рецессивных летальных мутаций, возникающих в Х-хромосоме зрелых сперматозоидов самцов дрозофилы.

Линия-анализатор Меллер-5 содержит в генотипе две инверсии sc⁸ и δ49. Инверсия sc⁸ захватывает большую часть Х-хромосомы. Для предотвращения возможного кроссинговера в этой инверсии в нее введена другая, более короткая, подавляющая кроссинговер в средней части Х-хромосомы, что приводит к полному подавлению кроссинговера в Х-хромосоме. Важно, что эти инверсии не влияют на жизнеспособность мух. Кроме того, линия Меллер-5 маркируется какими-либо видимыми мутациями (например, w^a-apricot - абрикосовые глаза и В-Bar - полосковидные глаза).

Самцов, подвергнутых мутагенной обработке, в возрасте 3-5 дней скрещивают с самками из линии Меллер-5 того же возраста, поскольку более молодые самцы имеют разную чувствительность к мутагенам, а у молодых самок обычно замедлена яйцекладка. Через двое суток эти мухи удаляются. Через 9-10 дней (при температуре опыта 24-25° С) начинается анализ мух F₁только двухдневных яйцекладок, так как на третий день в оплодотворении участвуют половые клетки, находившиеся на стадии сперматид в момент обработки самцов.

Самцы первого поколения имеют фенотип линии Меллер-5. У самок глаза красные, более узкие, чем у мух дикого типа (действие неполнодоминантного гена В), каждая из них имеет одну Х-хромосому, пришедшую от отца. В этой Х-хромосоме у некоторых самок F₁ может быть локализована вновь возникшая рецессивная летальная мутация, у большинства самок леталь отсутствует. Для того, чтобы определить, какая из них несет летальную мутацию в Х-хромосоме, в первые 2-3 дня лета мух к проводят индивидуальные скрещивания самок F₁ с самцами из линии Меллер-5. (Скрещивание с самцами первого поколения нецелесообразно, так как они могут иметь мутации или хромосомные аберрации в Y-хромосоме, полученной ими от мутагенизиро-ванного отца, влияющие на жизнеспособность и плодовитость этих самцов.) Через 9-10 дней в течение 9 дней проводится анализ F₂; культуры просматриваются ежедневно.

Если в Х-хромосоме самки F₁ летальная мутация отсутствует, то в потомстве F₂ проявляется расщепление: половина самцов и самок имеют дикий фенотип, половина - фенотип линии Меллер-5. Работа с такой культурой прекращается.

Рис. Х.1. Количественный учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы. Метод Меллер-5

Если в Х-хромосоме самки F₁ содержалась леталь, то в F₂ за 8-9 дней лета не появятся нормальные самцы. Для проверки нескольких самок из этой культуры вновь скрещивают с самцами Меллер-5 и анализируют F₃. При отсутствии нормальных самцов и в F₃ делается вывод о наличии летальной мутации в Х-хромосоме исследуемой самки F₁ (рис. Х.1). Частота леталей определяется как доля (%) Х-хромосом, несущих летальную мутацию, от общего числа проанализированных Х-хромосом. Например, если в опыте изучено потомство 800 самок F₁, т. е. 800 Х-хромосом, полученных от исходных мутагенизированных самцов, и летальные мутации обнаружены в потомстве 26 самок (в 26 Х-хромосомах), то частота возникновения рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме в данном опыте составляет 3,25% (²⁶/₈₀₀×100%). Преимущество этого метода заключается в чрезвычайно простом учете результатов: культуры просматриваются через стекло пробирок, без наркотизации мух.

В линии СlВ кроме одной большой инверсии и маркера В (Bar), содержится рецессивная леталь в гетерозиготном состоянии, поэтому в F₁ не образуется самцов СlВ и в F₂ появляются только нормальные самцы, если в Х-хромосоме нет летали. Если Х-хромосома, полученная самками F₁ с гаметой мутагенизированного самца, несет леталь, то в F₂ вообще не появляются самцы. В этом методе также используются самцы и самки 3- 5-дневного возраста, и учет проводится в потомстве двухдневных кладок самок F₁ при индивидуальных скрещиваниях путем просмотра культур без наркотизации мух (рис. Х.2). Метод СlВ в настоящее время применяется редко, так как одна инверсия неполностью "запирает" кроссинговер.

Рис. Х.2. Количественный учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы. Метод СlВ

Поскольку мутация - событие достаточно редкое, при постановке конкретного опыта важно оценить, какое количество самцов следует облучить и какое количество культур нужно поставить. Очевидно, что увеличение числа обработанных самцов и культур увеличивает вероятность выявления мутаций. При расчете можно исходить из того, что для получения F₁ в каждую пробирку среднего размера помещают по 2-3 самки и 3-4 обработанных самца. От двухдневной кладки в каждой пробирке можно получить до 100 и больше мух (в зависимости от дозы мутагена).