Методика

Быстрое выделение ДНК

1. Прямо из колоний штаммов, полученных в эксперименте 5, выделите ДНК. Можно выделять ДНК также и из небольших жидких культур объемом 1 мл. При выделении ДНК из колоний следуйте методике 12-II. Ресуспендируйте ДНК в 50 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис (рН 7,5), 10^-4 М Na₂-ЭДТА, 10 мкг/мл РНКазы.

Расщепление рестрикционной эндонуклеазой

2. Расщепите 10 мкл полученной выше ДНК рестриктазой EcoRI, 10 мкл рестриктазой HindIII и 10 мкл совместно рестриктазами EcoRI и BamHl или EcoRI и HindIII, или HinIII и BamHI.

Электрофорез в геле

3. Каждую пробу расщепленной ДНК нанесите целиком в одну ячейку геля 0,7%-ной агарозы. Пользуйтесь трис-ацетатным буфером. Проводите электрофорез в течение ночи (при 20 В в течение 18 ч или при 30 В в течение 12 ч).

Используя методику 21-I, перенесите ДНК из геля на нитроцеллюлозу. Перенос проводите в течение ночи.

Гибридизация с набором рестрикционных фрагментов

4. Снимите полоску нитроцеллюлозы с геля, промойте и проведите отжиг. Поместите его в герметизируемый мешочек и добавьте зонд, как описано в методике 23.

После гибридизации в течение по крайней мере 24 ч выньте полоску нитроцеллюлозы, на которую был перенесен материал из геля, из мешочка, в котором проводилась гибридизация. Промойте ее, промокните досуха, оберните в пластиковую пленку и экспонируйте с рентгеновской пленкой.

Проявите пленку. Напишите на ней полное время экспозиции. Если экспозиция оказалась недостаточной, то заложите новую пленку.